SEP
SNEST
DGEST
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA:
BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA
No.4
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE
MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
PROFESOR:
MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC EN
BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma.
Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana
Vely García Banderas (08930286)
Anel
Mojica Macedo (08930287)
Mayra
Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice
Rubí Pérez Sánchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro. México.
23 de marzo del 2012.
SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN
- VITRO)
RESUMEN
La
presente práctica se realizó en el laboratorio de microbiología del Instituto
Tecnológico de Cd. Altamirano, Gro. Cuyo objetivo fue conocer el manejo
apropiado del material vegetal en cámara de flujo, así como la asimilación de
habilidades en la siembra. Para lo cual se utilizó papel higiénico, pinzas,
bisturíes, cajas de Petri estériles, tapabocas, mechero, alcohol al 70% y 100%
y agua destilada. Se preparó la cámara de flujo laminar desinfectando con
alcohol en su interior, posteriormente el material vegetal y los medios
preparados se transfirieron en la cámara, después se esterilizó el material vegetal con alcohol y agua y
posteriormente se sacó en una caja de Petri donde se dividió en partes
pequeñas, posteriormente se sembró el material vegetal en cada uno de los
frascos de medios de cultivo sellándolos completamente cada uno, una vez que se
sellaron fueron guardados en un anaquel para su optimo crecimiento.
Palabras clave:
material vegetal, cámara de flujo
laminar, medios de cultivo, siembra.
SUBCULTURE (PLANTING MATERIALANDESTABLISHEDIN
-VITRO)
SUMMARY
Thispracticewas conducted in themicrobiology
laboratory of theTechnological Institute of CiudadAltamirano, Guerrero. Aims to better
understandthe proper handlingofplant materialflow chamberand theassimilationof
skillsin planting.Whichwas usedfortoilet paper, forceps, scalpels, sterilePetri dishes, masks, cigarette, alcohol 70% and 100% and
distilled water.Was prepared inthelaminarflow chamberdisinfectedwith alcoholin
its interior,andsubsequentlythe plant materialprepared mediawere
transferredinto the chamber,afterthe plant materialwas sterilizedwith alcohol
andwater and thenpulledinaPetri dishwhichwas dividedinto small parts, thenthe plant materialwas plantedineachculture
mediabottlescompletelysealing themeachoncesealedwere kepton a
shelfforoptimalgrowth.
Keywords: Plant material, laminar flow
chamber, culture media,
plant.
ÍNDICE
Pág.
I.Antecedentes………………………………………………………………………….…5
II.Definición del problema……………………………..…………………………...….…7
III.Objetivos……………………………………………………………………………..….8
IV.Justificación………………………………………………………….…………….......9
V.Fundamento teórico……………………………………….……………..……………10
VI.Materiales y Métodos…………………………………………………………......….15
VII.Resultados y discusión…..………..…………………………………………….....22
VIII.Conclusiones y
Recomendaciones………..……………………………………..25
IX.Fuentes consultadas……………….……………………..……………………....…26
X.Anexos………………………………...……………………………………………….27
I.ANTECEDENTES
El cultivo de tejidos vegetales o
cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en
condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento
inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de
plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es
aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en
un medio de cultivo. A diferencia de las
técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la
propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo
de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran
utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas,
en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería
genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que
en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de
cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas
ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la
estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción (Kite, L., 1983)
La década de los 70 puede considerarse la
“década prodigiosa” del cultivo in vitro en España. De esta época saldrán los
líderes que serán los responsables de los grupos más consolidados del cultivo
in vitro. Líderes que, de alguna forma y porque la historia así lo quiso,
completan su formación en las dos escuelas del cultivo in vitro de entonces. De
una parte, destaca el Dr. White en USA que, en 1934 publica el cultivo
indefinido de la raíz de tomate; por otra, merece mención especial Gautheret,
en Francia que, en 1939 publica por vez primera el cultivo indefinido de callos
de zanahoria. Las dos “escuelas” utilizan el cultivo in vitro como herramienta
de trabajo pero mientras los americanos tratan de utilizarla como una
metodología para resolver problemas reales que les preocupan, la “escuela”
europea trata de utilizar el cultivo in vitro como una herramienta que le
permita conocer aspectos fundamentales de la histodiferenciación celular. En
aquella época las diferencias eran tan notables que mientras los europeos
cerraban sus tubos de cultivo con algodón y “papel de estaño” (que era como se
le llamaba entonces al actual albal) los americanos lucían en sus gradillas el
colorido multicolor de los famosos Kap-uts de Bellco (Antonio Ballester, 1999).
En octubre de 1994, se inició la operación de un
laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio
Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de
desarrollar técnicas para la propagación de especies vegetales de interés ecológico
y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos
en especies ornamentales de interés económico en la región. A la par de estas
actividades, se ha hecho promoción del proyecto en los medios de comunicación
locales con el fin de dar a conocer al público las ventajas de utilizar la
técnica mencionada para la propagación de plantas ornamentarles difíciles de
obtener por los métodos tradicionales., (Davies R.D. et al, 1980)
La
totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en
1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de
regenerar plantas completas.
Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la
división celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluían
reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en
ese momento. Recién en 1934,
Philip
White pudo mantener, en forma
ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del
tallo de tomate. Al mismo tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA),
que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in
vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de
Datura stramonium. En
1948 Folke
Skoog y Cheng
Tsui, trabajando con
cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación
química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la
misma especie, con el agregado de cinética, la primera citocinina descubierta,
permitieron demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos,
estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas (Mroginski, Sansberro y Flaschland,
2010)
II. DEFINICION DEL PROBLEMA
En esta presente practica se realizo la siembra de
los explantes de yuca de manera
adecuada para que no se contaminen con bacterias y hongos y se puedan
desarrollar las plántulas de manera libre y logre crecer para extraerlo y
cultivarlo nuevamente a un medio de cultivo in vitro. Cabe mencionar que se
requiere mucho cuidado al realizar la siembra de los explantes ya que si no se
realiza una buena siembra el cultivo se contaminara esto debido a que es
posible que el explante traiga una cepa de hongo o bacteria o que el cloro
utilizado no fue muy eficiente.
III. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
v Conocer la forma de establecer
un medio de cultivo y la forma de
sembrar los explantes en el medio de cultivo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
v
Conocer
el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo Yuca: Manihot
esculenta).
v
Asimilación
de habilidades en la siembra.
IV. JUSTIFICACION
Esta práctica se realizo con la finalidad de saber
cómo sembrar un explante ya que debido a esto se realizara en un medio de
cultivo en el cual será sembrado un explante de yuca (Manihot
esculenta) con la finalidad de que logre
crecer libre de enfermedades. La siembra se realizo en la campana laminar la
cual se preparo y fue desinfectada con alcohol al 70° para estar libre de
contaminantes y se desarrollen los explantes.
V. FUNDAMENTO TEORICO
5.1 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy
heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante o sea,
una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio
artificial de composición química definida y se incuba en
condiciones ambientales controladas. Estas técnicas pueden ser utilizadas en
vegetales como herramientas para micropropagación, propagación
rápida de clones,
eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides,
aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y
selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios
básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. (Flaschland,
2010).
El cultivo de tejidos se inicia con
la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente
higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los
tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente
estéril sin introducir microorganismos
contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir
del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En
algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada,
conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras
reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros
órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un
microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del
medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente
confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane
la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida
que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que
ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos»,
deben proveerse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden
necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la
superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden
colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro
de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento
vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como
fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce
que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para
el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es
necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la
de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los
carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que
de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios
altos niveles de luz. (Neumann, K.H. 1997).
5.2 BASE BIOLÓGICA
La reproducción asexual de plantas por
cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una
planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el
desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de
células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencialidad
celular y es característica de un grupo de células vegetales
conocidas como células meristemáticas, presentes en
distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada
(una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y
eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación
alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según
las condiciones de cultivo a las que se la someta. El éxito en la propagación
de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad celular,
es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática. Para
ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación
celular. En condiciones naturales, un proceso de este carácter sucede durante
la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la
formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de cualquier
planta. Entre los factores más importantes para lograr la respuesta
morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo
intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el
carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal
propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en
cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de
compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos,
denominados reguladores del crecimiento, son los que se
emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta.
(Haberlandt, G. 1902).
5.3 ETAPAS DEL PROCESO
El cultivo de tejidos
vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la
obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las
cuales se enumeran a continuación:
- Elección de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
- Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explante.
- Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
- Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
- Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro
permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren
simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes,
asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz. (Hicks G.S. 1980).
5.4 TIPOS DE MORFOGÉNESIS
En condiciones de cultivo in vitro,
las células somáticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, raíces y/o
flores. La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos
morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La
embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura
similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas,
mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos
se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través de un
complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende diferentes
fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis como para la
embriogénesis somática. Estas fases se denominan adquisición de la competencia;
fase de inducción y fase de realización. En la primera fase, las células no
responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una
fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células
son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo,
concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio
de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula
sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado. A partir de
la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en
condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos
órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la formación es de
brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se
induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará
embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un
explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y
sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o
suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada
morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los
meristemoides. (Banner, J. 1936).
VI.MATERIALES Y MÉTODOS
La
presente práctica tuvo lugar en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, en
el laboratorio de Microbiología.
Se inicio con la
desinfección de la campana de flujo laminar con alcohol preparado anteriormente
al 70%. Los materiales vegetales y los medios preparados se introdujeron en la
cámara, las manos se desinfestaron con alcohol al 70 %, después de secarlas
completamente, se inició con el trabajo dentro de la cámara, la superficie de
los recipientes con medio de cultivo se limpiaron con papel higiénico
impregnado con alcohol (normalmente no se utiliza algodón, puesto que se llena
de polvo fácilmente).
Previamente se preparó cloralex al 2 % en un
frasco, donde posteriormente se introdujeron los explantes dentro con ayuda de
las pinzas, permanecieron ahí durante 5 minutos, se agitaba periódicamente
Figura 3. Preparación de cloralex
al 2 %.
Figura 4. Desinfestación de
explantes
Figura
5.
Explantes vegetales en cloralex
al 2%.
Se colocaron dos frascos con agua y un frasco con alcohol del 96%, los cuales
se utilizaron para el lavado. La pinza que se utilizó anteriormente para poner
los explantes en el frasco del cloralex se mete en el frasco del alcohol al
96%, se flameo para eliminar algún tipo de hongo o bacteria, y se dejó enfriar
en un frasco vacío, esto se llevó a cabo al término de ser utilizado un
material como pinza o bisturí.
Figura
8.
Frasco portador de materiales desinfectados.
Ya transcurridos los 5 minutos, en un vaso de
precipitados se vertió el cloro que contenían los explantes y se realizó el
lavado con agua estéril, se mantuvieron ahí durante un minuto, transcurrido ese
tiempo se vertió el agua al vaso de precipitados y se inició con el lavado de 5
minutos, se retiro el agua nuevamente, terminado esto, se retiraron los frascos
que fueron utilizados para mantener limpia el área de trabajo.
Figura 9. Lavado de explantes con agua estéril.
Después se colocó el frasco de alcohol, el mechero y
los frascos con pinzas y bisturí, en
este orden para evitar accidentes a la hora de la esterilización.
Figura
10. Orden del material para
evitar accidentes.
Se utilizó una caja de Petri estéril, se empezó a
trabajar en una tapa de esta, obtuvimos dos explantes con ayuda de las pinzas y
con el bisturí se cortaron los extremos los cuales fueron dañados por el cloro,
posteriormente se diseccionaron los explantes para que cada yema o brote
quedaran separados, una vez que se termino, se esterilizaron las pinzas y se
colocaron en un el frasco vacío, se tomaron otras frías.
Figura 11. Obtención y disección de
explantes vegetales
Se tomo el frasco del medio de cultivo, se quito
el sello y tapa la cual se puso sobre otra tapa de un frasco para evitar
contaminación, se tomo un explante con las pinzas y se coloco en el medio con
cuidando que este quedara dentro del mismo y la dirección de los ápices hacia arriba de lo contrario se obstruiría su
crecimiento, este procedimiento fue el mismo para el cultivo de explantes en el
medio de 14 frascos.
Figura
12. Siembra del explante vegetal en el
medio de cultivo
Una vez culminada la siembra se sellaron los
frascos y colocaron en el área de crecimiento
Figura 13. Frasco sellado y listo para instalarse en el área de crecimiento.
VII. RESULTADOS Y DISCUSION
Se
cultivaron 15 explantes in vitro de Manihot
esculenta, de los cuales 5 se contaminaron por hongos en la superficie
inferior del explante, lo cual se puede atribuir a que el explante se
encontraba contaminado por alguna cepa de hongo o que el cloro ya no era
eficiente, pero este factor no perjudico los brotes foliares en el explante.
Figura.
Explantes sembrados invitro
Figura.
Crecimiento foliar del explante
Figura.
Explantes contaminados
El
33 % de los explantes sembrados in vitro han sido contaminados por la presencia
de un hongo.
Según
Bregmann y Moon lograron un mayor número de brotes en diversas especies de
Paulownia al utilizar reguladores de crecimiento, lograron incrementar el
número de brotes cuando los explantes incluían parte del peciolo.
Por otra parte
Kadkade y Seibert encontraron que se mejoro la eficiencia tanto para el
crecimiento en callo como para la organogénesis al exponer los cultivos a la
luz roja durante cinco minutos todos los días.
VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones:
Debido a lo realizado ya antes
mencionado en la presente practica se concluye que si la siembra de material in
vitro se realiza de forma aséptica: esterilizando el material a utilizar,
desinfectándose las manos con alcohol, los resultados son favorables, es decir
el material cultivado no se infecta de hongos o bacterias; también se concluye
que probablemente la planta que se utilizo (manihot
esculenta) estuvo contaminada debido a que el primer día después de la
siembra se presento un micelio alrededor del explante.
Recomendaciones:
- La forma de colocar los frascos en la campana de flujo laminar debe ser
frasco con alcohol- mechero - frascos con pinzas para un mejor manejo de material
que se utilice.
- Todo el material a utilizar debe esterilizarse y estar cubierto con
papel o aluminio para evitar que este se contamine.
- Se recomienda que solo se encuentren dos personas: uno para que se
encargue de sembrar el material in vitro y el otro para que lo apoye pasándole
el material esto para evitar que se infecten los medios de cultivo.
IX.FUENTES CONSULTADAS
v Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland.
2010. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 70-84.
v Antonio Ballester,
1999 http://digital.csic.es/bitstream/10261/3975/1/
secivtv.pdf
v Kite,
L. (1983), Plant from Test Tubes: an
Introductions to Micropropagation. Timber Press Oregon U.S.A.
v Davies
R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth
John Innes Symposium the Plant Genoma and Second.
X. ANEXOS
v Se
adquirió un anaquel de cinco laminas para adecuar el área de incubación cerca
de la campana de flujo laminar y a un lado de la ventana para recibir la poca
luz sola que entra.
Figura.
Anaquel
v Debido
a que la luz solar no es la suficiente para todos los niveles del anaquel se
requiere hacer la compra de una lámpara para que todos los explantes reciban la
misma intensidad de luz.
Figura.
Lámpara
