Berenice: febrero 2012

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO

BIOTECNOLOGIA

MC: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

ALUMNA: BERENICE RUBI PÉREZ SÁNCHEZ

SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA TECNOLÓGICATTECNOLÓGICA

FEBRERO 2012 VIII SEMESTRE LIC. EN BIOLOGIA

SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR

D IRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA TECNOLÓGICATTECNOLÓGICA

UNIDAD II.- CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

INTRODUCCIÓN

En esta unidad se estudiara acerca del cultivo de tejidos vegetales el cual es un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal

OBJETIVO

Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación

METODOLOGIA

El presente trabajo se realizara publicando en el blog los temas vistos en clase de acuerdo al avance que se tenga, lo cual se hará dependiendo el tiempo con que se cuente esto puede ser diariamente o cada tercer día y los temas partirán de acuerdo al temario; estos temas pueden o no incluir tareas de acuerdo al contenido. Es por ello que esperamos la comprensión del maestro al calificar.

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

2.1.1 ÁREAS DE LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDO

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en la práctica, las áreas principales son las siguientes:

Ø Área de lavado

Aquella donde se van a lavar los materiales utilizados y a limpiar los explantes debe incluir un lavadero con agua caliente y agua fría y una fuente de agua con alto grado de pureza, anaqueles o muebles de secado y debe tener botes de basura para desechar el material vegetal, inorgánico y de vidrio

Ø Área de preparación de medios

Considerada un área gris esta se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio y plástico y los reactivos químicos. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios; los materiales en esta área son balanzas, medidor de pH, platos calientes con agitación, matraces, vasos de precipitado, botellas, probetas, pipetas, parrillas de calentamiento y frascos de cultivo

Ø Área de esterilización

Considerada como área gris aquella donde el material y los medios de cultivo preparados se deben esterilizar; esta debe tener el espacio adecuado para las autoclaves las cuales pueden ser pequeñas (olla de presión) o grandes (de carga frontal y enfriamiento rápido y lento) según sea el volumen del material

Ø Área de siembra

También llamada área de transferencia, conocida como área blanca, en esta rea se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. La siembra se realiza dentro de una cámara de flujo laminar para la eliminación de partículas en el aire y asegura un ambiente aséptico

Ø Área de incubación

Se le conoce como área de crecimiento in vitro y es un área blanca debe proporcionar un buen control de temperatura, iluminación y humedad relativa. Debe tener estantes de metal o madera para colocar los cultivos

Ø Área de rusticación

Llamada también área de adaptación o endurecimiento, las plantas generadas en el área de incubación se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantarse en macetas o bandejas esto se puede llevar a cabo en casas de malla y generalmente son puestas en condiciones de campo

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

En esta materia es necesario conocer el material y equipo de laboratorio de cultivos celulares para saber cuáles son los más utilizados y como se usan para la preparación de medios de cultivo, para un buen funcionamiento y que los resultados de las prácticas que se realicen sean los esperados.

Material de vidrio

Ciertos materiales son creados y graduados para poder medir volúmenes con mayor precisión; en estos casos se habla de material volumétrico como son:

- Vaso de precipitado: es un recipiente cilíndrico de vidrio fino que se utiliza, sobre todo, para preparar o calentar sustancias y traspasar líquido

- Matraz erlenmeyer: es un frasco transparente de forma cónica con una abertura en el extremo estrecho, generalmente prolongado con un cuello cilíndrico, que suele incluir algunas marcas, por su forma es útil para realizar mezclas por agitación y para la evaporación controlada de líquidos; además, su abertura estrecha permite la utilización de tapones

- Tubo de ensaye: es un tubo cilíndrico pequeño utilizado en la contención de muestras líquidas

- Botellas de cultivo: el propósito de estas es el cultivo in vitro de plantas

- Cajas de petri: es un recipiente redondo, de cristal o plástico, con una cubierta de la misma forma que la placa, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética

- Pipetas: es un instrumento volumétrico de laboratorio que permite medir la alícuota de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio. Está formada por un tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) indicando distintos volúmenes

- Probetas: cilindro graduable es un instrumento volumétrico, que permite medir volúmenes considerables puede ser de vidrio o plástico

Esterilizadores

- Cámara de flujo laminar: es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de trabajo, que normalmente permanece limpia y estéril

- Hornos para secado: se usan para el secado del material de vidrio lavado y para la esterilización de instrumentos usados para el cultivo

- Autoclave: es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua.

- Refrigerador: es utilizado para mantener las temperaturas necesarias para algunas soluciones, medios o células

Instrumentos de precisión o pesado

- Balanza granataria: como instrumento de medición auxiliar, ya que aunque su precisión es menor que la de una balanza analítica, tiene una mayor capacidad que ésta y permite realizar las mediciones con más rapidez y sencillez, así como por su mayor durabilidad y menor costo

- Balanza analítica: es un instrumento utilizado en el laboratorio, que sirve para medir la masa, generalmente son digitales, y algunas pueden desplegar la información en distintos sistemas de unidades

- Agitador magnético: consiste de una pequeña barra magnética (llamada barra de agitación) la cual esta normalmente cubierta por una capa de plástico (usualmente Teflón) y una placa debajo de la cual se tiene un magneto rotatorio o una serie de electromagnetos dispuestos en forma circular a fin de crear un campo magnético rotatorio. Es muy frecuente que tal placa tenga un arreglo de resistencias eléctricas con la finalidad de dotarle de calor necesario para calentar algunas soluciones químicas

- Medidor de pH: son aquellos que utilizan un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan como indicador sustancias químicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolución

PRACTICA 1

SEP SNEST DGEST
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA

PRACTICA No.1

RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE

PRESENTAN:
Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana Vely García Banderas (08930286)
ANEL MOJICA MACEDO (08930287)
Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 20 de Febrero del 2012

RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com

RESUMEN

La presente práctica se realizo en el laboratorio de cultivo de tejidos del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano con el objetivo de conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio, para lo ello se hizo un recorrido por el laboratorio, describiendo donde se encontraba cada área y los materiales y equipos que hay en cada una de ellas. El resultado de esto fue conocer como está organizado el laboratorio de cultivo de tejidos así como las funciones de las áreas, que reactivos se encuentran en ellas y cuál es el cuidado, manejo y mantenimiento de las áreas. Con esto se puede concluir que al conocer todo el funcionamiento de este laboratorio se podrán realizar las prácticas de manera adecuada y esto hará que se tengan los resultados deseados.

Palabras clave: Laboratorio, cultivo de tejidos vegetales, reactivos

INDICE
                                                                                                       Pág.
Antecedentes……………………………………………………………………………..…………4
Definición del problema…………………………………………………………….…..…............…5
Objetivos……………………………………………………………………………………….…...6
Justificación……………………………………………………………………………………….…7
Fundamento teórico………………………………………………………………..………….......…8
Materiales y Métodos…………………………………………………………………………........14
Resultados……………………………………………………………………………………...…..16
Conclusiones y Recomendaciones………………………………………………………..................24
Fuentes consultadas………………………………………………………………………......….…25
Anexos………………………………………………………………………………………..……26

I.   ANTECEDENTES

El laboratorio es un lugar dotado de los medios necesarios para realizar investigaciones, experimentos, prácticas y trabajos de carácter científico, tecnológico o técnico; está equipado con instrumentos de medida o equipos con que se realizan experimentos, investigaciones o prácticas diversas, según la rama de la ciencia a la que se dedique. También puede ser un aula o dependencia de cualquier centro docente, acondicionada para el desarrollo de clases prácticas y otros trabajos relacionados con la enseñanza.
Su importancia, sea en investigaciones o a escala industrial y en cualquiera de sus especialidades (química, dimensional, electricidad, biología, etc.), radica en el hecho de que las condiciones ambientales están controladas y normalizadas, de modo que se puede asegurar que no se producen influencias extrañas (a las conocidas o previstas) que alteren el resultado del experimento o medición: control. De igual forma garantiza que el experimento o medición es repetible, es decir, cualquier otro laboratorio podría repetir el proceso y obtener el mismo resultado: normalización.
La historia de los laboratorios está influida por la historia de la medicina, ya que el hombre, al profundizar acerca de cómo es su organismo, ha requerido el uso de laboratorios cada vez más especializados para poder demostrar científicamente y de manera practica como se llevan acabo los diferentes procesos fisiológicos de los seres vivos.

II.   DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

El laboratorio requiere de áreas específicas para cada uno de los materiales y equipos, ya que cabe mencionar que algunos de estos no estan en un espacio adecuado. Pero sobre todo hace falta que se refuerce de materiales para contar completamente con un laboratorio bien equipado ya que debido a ciertas razones económicas la escuela no cuenta con el apoyo necesario para su obtención de estos. Por lo tanto es necesario buscar una solución para que los materiales se ubiquen en áreas de acuerdo a su función, teniendo su propio lugar correspondiente.

III.   OBJETIVOS

3.1   Objetivo general

Conocer las áreas del laboratorio de cultivo de tejidos

3.2   Objetivos específicos
- Conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.      -Conocer las principales normas de comportamiento y seguridad dentro del laboratorio

IV.   JUSTIFICACION

Esta práctica se realizo con la finalidad de reconocer el material de laboratorio que se utilizara en esta unidad temática, es de gran importancia reconocer e identificar los diferentes instrumentos o herramientas de laboratorio, ya que de esta manera seremos capaces de utilizarlos adecuadamente y también de llamarlos por su nombre y conocer su utilidad, también es importante mencionar que el laboratorio puede ser dividido en diferentes áreas como son área de preparación, área lavado, siembra, crecimiento y aclimatación, cabe mencionar que el laboratorio no está divido por áreas y que no presentas los equipos necesarios que pueden llagar a utilizarse.

V.   FUNDAMENTO TEORICO

V.I Cultivo de tejidos vegetales
El punto de partida para el cultivo de tejidos es la iniciación. Este es el proceso por el cual se trae material vegetal in vivo en un medio de cultivo estéril. Requiere la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir su punto de crecimiento o tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán desde este inicio dependerá de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos. El cultivo de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.

V.II Crecimiento de tejido vegetal
Estos tejidos in vitro están ahora dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico; y son protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos; Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben darse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido. Ellos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y un cocktail de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Es conveniente preparar este medio ambiente nutricional incorporando estos compuestos químicos dentro del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en uno separado.

Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz, pero a intensidades muy bajas, mucho más que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios unos altos niveles de luz.

V.III Áreas de laboratorio de cultivo de tejidos
El laboratorio de cultivo de tejidos vegetales debe tener áreas para las diferentes funciones que en él se desarrollen entre ellas están:

   Área de preparación.- utilizada para preparar los medios de cultivo, la cual debe tener un espacio para poner los materiales de vidrio, plásticos y reactivos

   Área de lavado.- debe incluir un lavadero con agua caliente y fría, su fuente de agua debe tener alto grado de pureza y debe tener basureros para depositar el material vegetal, inorgánico y de vidrio que sea desechado

   Área de esterilización.- debe tener espacio para la autoclave la cual puede ser pequeña o grande según el volumen del material que se procese. También debe incluir espacio para estufas y secadores

   Área de transferencia.- se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. En esta área se demandan altos niveles de limpieza por lo que se debe tener gabinetes de flujo laminar

   Área de incubación.- esta área debe contar con un buen control de la temperatura, iluminación y humedad relativa; se instalan estantes para colocar los cultivos, además de que esta área debe tener buena distribución de aire

   Área de observación.- su objetivo es realizar observaciones periódicas de los cultivos tanto en medios semisólidos como en líquidos. En esta se encuentran los microscopios

   Área de crecimiento.- las plantas generadas en el área de incubación se pueden acondicionar y luego trasplantar en masetas estas se pueden llevar a cabo en casas de malla o invernadero dependiendo de las condiciones donde se ubique el laboratorio

V.IV Equipo de laboratorio
   En el área de preparación: refrigerador, balanzas (una macrobalanzas y una de precisión), potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos (125, 250 y 500 ml), botellas y material de vidrio o plástico

   En el área de lavado y esterilización: Autoclave manual o automático, destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de vario tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para esterilización y secado.

   En el área de trasferencia: gabinete de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente y instrumentos de disección: cuchillas, mangos para cuchillas, aguja de disección, pinzas, tijeras, navaja de afeitar

   También se necesitan frascos con alcohol, mechero de alcohol, mascas, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas, y taco para basuras.

   En el área de incubación: un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas; estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima y gradillas para tubos de varios tamaños.

   En el área de examinación: microscopio estereoscopio, microscopio compuesto, lentes de aumentos, y elementos óptico complementarios.

   En el área de crecimiento en vivo: macetas, suelo, bandejas, cámaras de alta humedad
V.V Requerimientos para una buena técnica de cultivo de tejidos
Uno de los requisitos básico para el éxito de la técnica de cultivo de tejidos es mantener los cultivos libres de microorganismos contaminadores:
Los Tejidos: Puede ser útil la inclusión de fungistáticos y bacteriostáticos en el medio de cultivo; el sulfato de gentamicina, la penicilina y el sulfato de estreptomicina (10 a 50 mg/litro), son algunos de los productos de amplio espectro que se pueden usar. El tratamiento de las plantas donantes del explante por medio de altas temperaturas (35 a 40oC) también es efectivo para la obtención de segmentos de tejido libres de bacterias y hongos sistémicos.
Los instrumentos: los instrumentos de trabajo se deben esterilizar antes de usarlo. Lo más aconsejable es trabajar con varios juegos de las misma herramientas y mantener la asepsia de las que se han usado, colocando es los instrumentos en alcohol etílico al 70% de 2 a 3 minutos, y flameándolos.

El exterior de los recipientes de cultivo: existe la posibilidad de que, durante el tempo trascurrido entres la esterilización de los recipientes con los medios de cultivo y el momento de usarlo se localicen en su exterior ciertos contaminadores, de tal manera que se mantenga estéril solo el interior de los tubos; por lo tanto, se debe flamear obligatoriamente la boca de cada tubo antes y después de sembrar el explante.

El investigador: El investigador es una fuente primaria de contaminadores.
El uso de batas de laboratorio y de guantes limpios y la protección del cabello, la boca y la nariz reducen la contaminación.
Las batas limpias y las mascaras son necesarias sobe todos cuando se trabaja en un laboratorio de flujo laminar de aire. Es esencial que los investigador se limpie bien las manos y los brazos (lavándolo con jabón y agua y enjugándolo con alcohol al 70%) antes de iniciar una sección de trabajo

VI.   MATERIALES Y MÉTODOS

Esta práctica se llevó a cabo el día lunes 13 de febrero del año en curso a partir de las 7: 00 a 8:00 A.M. en el laboratorio de microbiología, dicha práctica lleva por nombre “reconocimiento del laboratorio de cultivo de tejidos”.
Antes de realizar la práctica los materiales requeridos para llevarla a cabo fueron: una cámara fotográfica la cual es para tomar evidencias de dicha práctica, un lápiz con que anotar y una libreta para anotar.
Durante esta práctica una vez contando con el material a ocupar, lo primero que se realizo fue una pequeña definición por parte del docente de lo que es un laboratorio, y los materiales que se deben encontrar dentro de él. Pues bien, posteriormente estando dentro del laboratorio se mencionó que este debe contar principalmente con mesas las cuales sirven para la preparación de los medios de cultivo, dichas mesas se encuentran distribuidas en una área adecuada para trabajar que estan ubicadas de la entrada hacia al frente.
Además también cuenta con una área de transferencia y siembra, está contando principalmente con una cámara de flujo laminar.
Una vez observada el área de transferencia y siembra, se hizo un pequeño recorrido en donde al lado izquierdo de las mesas se mostró la olla de presión para la esterilización de los materiales que se utilizan en las prácticas, materiales tales como son: cajas de Petri, matraz Erlen Meyer, vasos de precipitados y materiales que se puedan esterilizar mediante la olla de presión.
Dando unos cuantos pasos más hacia al fondo nos encontramos con el área de esterilización en donde se observó el autoclave vertical.
Saliendo del área de esterilización se mostró el refrigerador en el cual contiene algunas soluciones concentradas como son las vitaminas y hormonas, mencionando que no es el área adecuada donde está ubicado ya que esta donde se encuentra dentro de lo que es el área de lavado.
A un costado del refrigerador se localiza el área de cristalería en donde pues sin duda alguna van todo material de cristal. Mencionando algunos así como lo son los tubos de ensayo, probetas, cajas de Petri porta objetos y cubre objetos.
Continuando con el recorrido se mostró el área de reactivos, en donde pues más que nada como su nombre lo dice se encuentra gran variedad de reactivos, además de eso se encuentran también los microscopios y estereoscopios los cuales son de gran utilidad para la observación de las muestras. Una vez estando en dicha área se hizo un paréntesis para dialogar sobre un mueble que se encuentra ubicada en esa área, esta conversación se hizo con el motivo de ver la forma de que ese muebla se convierta en una vitrina para darle uso adecuado.
También dicho laboratorio cuenta con un área de lavado y escurridores para escurrir el material una vez que este se ha dado una limpieza.

Finamente una vez que se terminó la observación, se discutió sobre cuál sería el lugar apropiado para el área de incubación tomando en cuenta los factores físico-químicos.   Y Se dio fin a esta práctica.

VII.   RESULTADOS

Los resultados de esta práctica fueron satisfactorios ya que durante el recorrido que se puedo observar, reconocer e identificar, cada una de las áreas del laboratorio así como los diversos materiales, reactivos y equipos de uso común existentes en cada una de ellas, además se definió y describió el uso del material. Dentro del laboratorio se reconocieron las siguientes áreas:

ÁREA DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS: se utiliza principalmente para preparas los medios de cultivo, cuenta con mesas de trabajo para la elaboración de los mismos. Para trabajar adecuadamente se deben mantener libres de cualquier contaminante por lo cual antes de su uso se deben esterilizar, estas mesas tienen integrada un área de lavado, tubos conductores de gas y agua. Cuenta con una balanza analítica la cual nos permitirá realizar con precisión el pesado de los reactivos a utilizar, así como con un refrigerador, este se utiliza para guardar y mantener en buen estado los medios de cultivo.

figura 1. mesa de trabajo figura 2. balanza analitica

figura 3. refrigerador

ÁREA DE REACTIVOS: se encuentran localizados en estantes, algunos se encuentran junto al material de cristalería. Dentro de los reactivos podemos encontrar compuestos inorgánicos como sales y compuestos orgánicos entre los mas importantes tenemos los reguladores de crecimiento ( auxinas, citocininas y giberelinas ), vitaminas, carbohidratos y aminoácidos los cuales son primordiales para el crecimiento de las plantas en un cultivo in vitro. En esta área se debe tener mucho cuidado al hacer una selección de los reactivos a utilizar en determinada practica, ya que de caso contrario los resultados que se obtengan no serán los deseados y se hará uso inútil de estos, algunos de ellos o en su mayoría son muy costosos por tal razón se debe tener total precaución a la hora de su utilización.

figura 4. estante de reactivos

ÁREA DE LAVADO Y ESTERILIZACIÓN: esta área cuenta con varios lavaderos con agua fría no se cuenta con agua caliente, existe jabón y esponjas para el lavado de materiales, así como con escurridores y charolas metálicas y de plástico que se utilizan para colocar el material después del lavado. Para la esterilización se utiliza la autoclave pequeña (olla de presión) y hay en existencia autoclaves verticales las cuales tienen mayor capacidad para material, se cuenta con una estufa.

figura 5. area de lavado figura 6. olla de presion y estufa

figura 7. autoclave vertical

ÁREA DE TRANSFERENCIA Y SIEMBRA: en esta área se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explante a los medios de cultivo, el material que se observó en esta área es la campana de flujo laminar la cual esta diseñada para extraer eficientemente tóxicos, nocivos y otros materiales dañinos del área de trabajo y de esta manera evitar la contaminación a la hora de la siembra, ya que esta actividad demanda los mas altos niveles de limpieza ambiental. Antes del uso de la campana de flujo laminar se debe desinfectar con alcohol y algodón.
Se localizan también microscopios y estereoscopios los cuales nos ayudaran en la función de seleccionar los mejores explantes vegetales mediante la observación de sus características microscópicas, para poder realizar la siembra del mejor.

ÁREA DE TRANSFERENCIA Y SIEMBRA: en esta área se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo, el material que se observó en esta área es la campana de flujo laminar la cual esta diseñada para extraer eficientemente tóxicos, nocivos y otros materiales dañinos del área de trabajo y de esta manera evitar la contaminación a la hora de la siembra, ya que esta actividad demanda los mas altos niveles de limpieza ambiental. Antes del uso de la campana de flujo laminar se debe desinfectar con alcohol y algodón.
Se localizan también microscopios y estereoscopios los cuales nos ayudaran en la función de seleccionar los mejores explantes vegetales mediante la observación de sus características microscópicas, para poder realizar la siembra del mejor.

figura 8. campana de flujo laminar

ÁREA DE INCUBACION Y CRECIENTO: el área de incubación o crecimiento aun no se encuentra totalmente estructurada ya que debido a que este laboratorio era de usos múltiples, no existía suficiente espacio, ni el lugar con las condiciones adecuadas para esta área. Por lo que se opto por elegir y acondicionar un espacio donde se pudiera tener más eficiencia en el control ambiental (temperatura, iluminación, humedad relativa y aislamiento) para el óptimo crecimiento de los explantes en el medio cultivo.

figura 9. espacio para condicionar area de incubacion y crecimiento

ÁREA DE OFICINA: dentro del área de oficina se observó un escritorio, equipo de computo y archivos de documentos relacionados con el las practicas de laboratorio.
Normatividad del laboratorio
Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.
•   Utilizar una bata y tenerla siempre bien abrochada, así protegerá la ropa y cuerpo de algún derrame de sustancia peligrosas y demás accidentes.
•   Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan.
•   El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.
•   Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.
•   Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
•   Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
•   Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.
•   Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: ácido sobre agua.
•   Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.

Es indispensable cumplir con cada una de las normas establecidas anteriormente para poder llevar acabo la practica de una manera adecuada y segura. Ya que de esta manera se podrán evitar accidentes y obtener mejores resultados en cuanto al uso de las diferentes áreas que constituyen el laboratorio.

VIII.   CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

De acuerdo a lo encontrado en el laboratorio de usos múltiples del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano se puede deducir que este no cuenta con todas las áreas adecuadas para realizar cultivos de tejidos vegetales, esto debido a que no se cuenta con el suficiente espacio, equipamiento y los reactivos y sustancias existentes no se encuentran ordenadas de una forma adecuada, además de que las condiciones en este no son controladas por ejemplo la intensidad de la luz y la temperatura, factores que resultan muy importantes en el cultivo de tejidos. Se pudo observar que en el área de preparación, lavado y esterilización no hay mucho problema porque se ajusta a las necesidades, mientras que el área de incubación aun no se encuentra definida ya que cultivos que se han realizado se colocan solamente en áreas estratégicas para su incubación, hecho que puede ser muy significativo en el desarrollo de algún explante.

Una vez mencionado la anterior podemos recomendar futuras alternativas o propuestas para ser realizadas en un tiempo no muy lejano ya que pueden ser muy útiles para la realización de prácticas futuras. Como ya se dijo el área de incubación es el principal problema en el laboratorio, así que como el área donde se encuentran los reactivos y sustancias es la mas apartada del laboratorio y por lo tanto menos transitada se recomienda establecer el área de incubación en ese cuarto, claro no es necesario desalojarlo en su totalidad, solo es cuestión de realizar un espacio en la parte del fondo para colocar un anaquel en ese lugar, otra opción puede ser la compra e instalación de laminas de acrílico a una pequeña vitrina, para incubar dentro los futuros cultivos de tejidos vegetales. Es recomendable traer material de vidrio como botellas de litro color ámbar para guardar las soluciones que se puedan preparar.

IX.   FUENTES CONSULTADAS

BOTTI, C. I. 1992. La producción de plantas in vitro. Guayaquil (Ec.), PROEXANT – AGRIDEC/ CHEMINICS.
HURTADO, D. V. ; MERINO, M. E. 1988. Cultivo de tejidos vegetales. 1 reimpresión. México, Trillas S. A. 132 p.
PIERIK, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de plantas superiores. Trad por Luis Ayerbe Mateo – Sagasta. Madrid, Mundi – Prensa. 326 p.
ROSELL C. H; VILLALOBOS, V. M. 1990. Fundamentos teóricos prácticos del cultivo de tejidos vegetales. Roma, FAO. 112 p.
VILLALOBOS, V. M. 1990. Fundamentos teóricos prácticos del cultivo de tejidos vegetales. México, Colegio de Postgrado – Centro genético.

X.   ANEXOS

Debido a que en la práctica realizada se encontró con que no se cuentan con las áreas de laboratorio requeridas para el cultivo de tejidos vegetales es recomendable adquirir el siguiente material para acondicionar el área de incubacion:

Fig. 1 Anaquel de 6 charolas
Anaquel con entrepaños de 1. 00 x 40cm y 4 postes de 2. 20cm, buen calibre, resistentes y aguantadores en color gris cuyo precio es de 370.00 en el D.F
También seria de gran utilidad la compra de láminas de acrílico para el acondicionamiento de un estante para la incubación de cultivos.

2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El término genérico “cultivo de tejidos vegetales” involucra a diferentes técnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales controladas. También se lo conoce como “cultivo in vitro de plantas” por realizarse en recipientes de vidrio (hoy también de otros materiales).

Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37°C, 5% CO₂ y 95% O₂) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo celular, y la variación de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresión de diferentes fenotipos.

Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminación con virus o priones de los productos farmacéuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de países con un riesgo mínimo de encefalopatía espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes purificada concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de células.

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Las células pueden crecer en suspensión o de manera adherente. Algunas células viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguíneo. Otras necesitan una superficie, como la mayoría de células derivadas de tejidos sólidos. A las células que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensión. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plástico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y diferenciación. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotípico que consiste en cultivar las células en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioquímica y fisiológicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades técnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusión).

Al estar generalmente las células en continua división durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar toda el área o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

Agotamiento de los nutrientes del medio
Acumulación de células apoptóticas o necróticas
Inhibición de la división celular por contacto: los contactos entre células pueden desencadenar un arresto del ciclo celular
Diferenciación celular promiscua provocada por los contactos intercelulares

Estos problemas pueden afrontarse mediante métodos de cultivo celular en esterilidad. El objetivo de estos métodos es evitar la contaminación con bacterias o levaduras que competirían por los nutrientes y/o podrían infectar y así eliminar las células. Toda manipulación se lleva a cabo, típicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. También pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo.

Entre las manipulaciones más comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las células y la transfección.

Bibliografía:

http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf

es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_celular

2.1.4 COMPONENTE DEL MEDIO DE CULTIVO

Los medios de cultivo son soluciones acuosas donde se desarrollan los microorganismos. El desarrollo de los microorganismos solo ocurre en presencia de los nutrientes requeridos (que dependen del microorganismo particular). Los nutrientes son las sustancias necesarias para la síntesis de material celular y la obtención de energía. Estos nutrientes son orgánicos e inorgánicos (solo las organismos litotrofos pueden crecer en soluciones exentas de nutrientes orgánicos). La diversidad del mundo microbiano hace que los medios de cultivo sean muy variados, tanto como determinen los requerimientos nutricionales de los microorganismos. Para el cultivo de bacterias heterótrofas todos los medios contienen como componentes principales: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas; así como otros componentes como algunos medios de cultivo incorporan sustancias con finalidades más concretas, como los factores de crecimiento, colorantes, tampones, agentes solidificantes, etc.

Componentes de los medios de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificante

- Agua suele utilizarse destilada. En ocasiones específicas puede utilizarse agua corriente, pero debe evitarse porque ciertos cationes (como Ca²⁺ o Mg²⁺) pueden formar sales insolubles con otros componentes del medio (como los fosfatos) sobre todo, durante la esterilización

- Sustancias orgánicas se pueden utilizar sustancias puras o mezclas de sustancias orgánicas Como sustancias puras más comunes se encuentran los azúcares: Frecuentemente son utilizados como fuente de carbono y energía por los microorganismos. Entre ellos, es común el empleo de monosacáridos como la glucosa, disacáridos como la lactosa y polisacáridos como el almidón. Ciertas bacterias no pueden utilizar los carbohidratos como nutrientes y se emplean otras sustancias puras (aminoácidos, ácidos grasos) o mezclas de sustancias orgánicas.

Sustancias inorgánicas (sales minerales) Sus funciones en un medio de cultivo pueden ser poco específicas,(como el NaCl para ajustar la osmolaridad del medio) o pueden ser requeridas específicamente en el metabolismo (como las sales de K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Fe³⁺, etc.). Quizá los requerimientos minerales más obvios son los de fósforo (necesario para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos), de azufre (aminoácidos cisteina y metionina) o nitrógeno (el segundo elemento tras el carbono entre los que forman la célula). Aunque se pueden utilizar fuentes orgánicas, es común usar como fuente de fósforo un fosfato, la de azufre como un sulfato y la de nitrógeno como nitrato o una sal de amonio.

Macronutrientes

— Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.

— Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas

— .Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento,

— Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.

— Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.

— Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos

— Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido.

Micronutrientes (los nutrientes necesarios en pequeñas cantidades) son esenciales para el funcionamiento de varias enzimas, y deben estar incluidos en el medio de cultivo. Su requerimiento en muy baja cantidad determina que frecuentemente no sea necesario añadirlos expresamente: es suficiente su presencia como contaminantes de otros componentes. No obstante si se utilizan componentes y agua de pureza muy altas los medios de cultivo pueden ser deficientes en micronutrientes

- Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.

- Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa

- Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2

en la fotosíntesis.

- Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado

en la síntesis de bases nitrogenadas como el Uracilo.

- Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, está ligado al proceso de lignificación.

- Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

- Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

- Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis.

Agentes solidificantes; Agar-agar Se añaden para preparar medios de cultivo sólidos y semisólidos. El agar-agar es el agente solidificante mas común. El agar-agar es un polisacárido de galactosa y galactomanano que se obtiene de las algas rojas (Echema, Gelidium, Gracilaria). Contiene un 70% de agarosa y un 30% de agaropectina. El agar-agar es el agente solidificante más utilizado. Su composición química es indefinida y solidifica con mayor dificultad a medida que desciende el pH. Es insoluble en agua fría, pero se funde y solubiliza en agua hirviendo y solidifica a 45º C. Forma geles transparentes muy estables y es degradado por muy pocas bacterias

El agar tiene una elevada masa molecular, como también la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C), solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su elevado costo.

Gelrita: Es un heteropolisacárido aniónico natural producido por una bacteria, que forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentración de 0,15-0,30%. Los geles de gelrita son notablemente más claros que los de Agar, y también cuajan más rápidamente. (Gar

El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

• Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo).

• Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos medios inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para la determinación de células viables (recuento en placas).

Reguladores de crecimiento

Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más

sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces

también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro

de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían

considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos

reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.

El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto se ha demostrado que clase y concentración de dichas sustancias interactúan con el genoma de la planta

Auxinas

Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo (Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de hidróxido

de sodio).

Las más utilizadas son:

IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces

ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces

IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes

2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.

Citoquininas promueven la división celular de yemas adventicias en callos y órganos de brotación

— Las Citoquininas más usadas son:

— BAP: (bencilamino purina)

— Kinetina

— 2-ip (isopentenil-adenina).

Giberelinas

Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con

mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor

(pierde el 90% de su actividad después del autoclavado) comparado con las auxinas

Acido abscisico

El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de

embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la

división celular.

Etileno

Interviene en procesos como: liberación de la dormancia, crecimiento y diferenciación de brotes y raíces, formación de raíces adventicias, abscisión de hojas, flores y frutos, inducción de floración en algunas plantas, senescencia de hojas, flores y maduración de frutos.

Vitaminas

La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.

La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial.

Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in

vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).

Fuentes de carbono

Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.

La sacarosa es la más utilizada para propósitos de micropropagación, generalmente

se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa.

Azucares pueden resultar adecuados para la micropropagación

Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:

— Son fuentes de energía.

— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.

BIBLIOGRAFIA:

http://agrobiotecnologia150437.blogspot.com/2011/05/componentes-de-un-medio-de-cultivo.html

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-i/pb-i-2-concepto.htm

2.1.4 PREPARACIÓN Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no.

Una solución stock es la cual a partir de ella se puede hacer una disolución:

Solución Stock Nueva Solución

figura 1. soluciones stock

Sales minerals MS (g/l)

(NH₄)NO₃ 1.650

KNO₃ 1.900

CaCl₂.2H₂O 0.440

MgSO₄.7H₂O 0.370

KH₂PO₄ 0.170

FeSO₄.7H₂O 0.0278

Na₂EDTA. 2H₂O 0.0372

MnSO₄.H₂O 0.0169

ZnSO₄.7H₂O 0.0086

H₃BO₃ 0.0062

KI 0.00083

Na₂MoO₄.2H₂O 0.00025

CuSO₄.5H₂O 0.000025

CoCl₂.6H₂O 0.000025

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotínico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002

Solución stock (estable 7 días en oscuridad y temperatura ambiente).

· Pesar los componentes en una balanza de precisión

· Asegurarse que el material que entrará en contacto con los componentes de las soluciones se encuentra perfectamente limpio. En caso de duda, lavarlo y hacer un último enjuague con agua destilada para retirar los restos de las sales minerales del agua corriente.

· Mezclar los componentes con la ayuda de un agitador magnético. Una vez obtenida la solución stock, etiquetar el recipiente que la contendrá indicando qué tipo de solución es, su concentración, la fecha en que se preparó y la persona que la hizo.

Preparación de solución stock

figura 2. dilucion de solucion stock

Al preparar una solución madre o stock, que se encuentra en una concentración mayor de la que se utiliza. A partir de ésta, se realiza una dilución para preparar la solución a la concentración de uso.

Se dice que una solución es “NX” (se lee “n por”) cuando está concentrada N veces respecto de la de uso corriente. Ej.: “PBS 5X” (PBS cinco por) es una solución stock de PBS 5 veces más concentrada que el PBS de uso normal. La solución de uso normal sería 1X.

Cuando se preparan mezclas a partir de soluciones stock, se diluye cada componente usando la siguiente ecuación: V1=V2C2/C1 donde V1 es el volumen de solución stock de la concentración C1 que debe ser añadida al volumen final (incluyendo TODOS los componentes) V2 de concentración final C2. Esta fórmula funciona tanto con concentraciones en molaridad, en % y en peso/volumen.

La mayoría de las sales y compuestos empleados en la preparación de soluciones stock son muy solubles en agua, al punto de permitir 500 y hasta 1000 diluciones para la preparación de medios enriquecidos. La concentración de algunas soluciones es muy baja. Algunos metales traza, vitaminas y demás nutrientes son primeramente diluidos para formar las soluciones que servirán para enriquecer un medio de cultivo. Se dicuelve la cantidad exacta del compuesto en 80-90% del volumen requerido en agua destilada. En una hornilla eléctrica o calentador magnético agitar suave y constantemente mientras se disuelve el compuesto. Se deja enfriar y luego se mide el pH de la solución ajustándolo cuando sea necesario. Se usa una probeta para enrasar el volumen final. En la preparación de una “solución stock de trabajo” que contiene una mezcla de compuestos (sales, vitaminas, etc) se disuelve cada uno por separado en un volumen mínimo de agua destilada, luego combinar estas soluciones y envase al volumen final deseado.

Almacenamiento de soluciones stock

Las soluciones stock se almacenan en botellas de vidrio o recipientes plásticos y se refrigeran. Si las soluciones preparadas van a ser autoclavadas pueden agregarse unas gotas de un preservante volátil, esto es una solución que contiene una parte de clorobenceno (v/v), una parte de 1.2 dicloroetano y dos partes de n-butilcloruro (1- clorobutano). Agitar fuertemente.

Bibliografía:

http://blogs.mdp.utn.edu.ar/mpersico/files/2010/04/Manual-medios-cultivo.pdf

http://html.rincondelvago.com/preparacion-de-soluciones_1.html

http://www.proz.com/kudoz/english_to_spanish/science/73355-stock_solution.html

SEP SNEST DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA

PRACTICA No.2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE

PRESENTAN:

Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)

Diana Vely García Banderas (08930286)

ANEL MOJICA MACEDO (08930287)

Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)

Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 27 de Febrero del 2012

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com

RESUMEN

La presente práctica se realizo en el laboratorio de usos múltiples del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica, así como manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos. Para lo cual se requirió vasos de precipitados, probetas, agua destilada, frascos ámbar y reactivos para preparan las distintas soluciones, en nuestro caso se trabajo con la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos, para ello se pesaron 4.25 g de KH₂PO₄, 0.155 g de H₃B0₃y 0.00625 g de Na₂MoO₄2H₂O, posteriormente se disolvieron en matraz a 100 ml y por ultimo se aforo a 200 ml con agua destilada. Por lo que se obtuvo una solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X, la cual fue etiquetada y guardada a 4 ⁰C. Así, esta práctica será de gran utilidad para la preparación de medios de cultivo, ya que estas soluciones se encuentran concentradas a 100X y su manejo será más fácil y apropiado.

Palabras clave: medio de cultivo, reactivos, solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos

PREPARATION OF SOLUTIONS MOTHERS

Yeka_rys@hotmail.com; diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com; melisa992 @hotmail.com

Abstract

This practice was held in the Multipurpose Laboratory Technological Institute of Ciudad Altamirano Gro. Aims to better understand the different components of culture medium and the nature of Chemistry and Biochemistry, and manage the basic techniques through proper use of reagents. Which was required for beakers, test tubes, distilled water, amber vials and reagents for preparing the various solutions, in our case we worked with the solution of phosphates, borates and molybdates, for it weighed 4.25 g of KH2PO4, 0.155 g and 0.00625 g H3B03 Na2MoO42H2O subsequently dissolved in 100 ml flask and finally diluted to 200 ml with distilled water. So as to obtain a solution of phosphates, borates and concentrated Molybdates 100X, which was labeled and stored at 4 0C. Thus, this practice will be useful for the preparation of culture media, as these solutions are concentrated at 100X and its handling is easy and appropriate.

Keywords: culture media, reagents, solution of phosphates, borates and molybdates.

ÍNDICE

Pág.

Antecedentes………………………………………………………………………….…5

Definición del problema…………………………………………………………...….…6

Objetivos…………………………………………………………………………………..7

Justificación…………………………………………………………….……………...…8

Fundamento teórico………………………………………….……………..……………9

Materiales y Métodos……………………………………………………………......….13

Resultados…………………………………………………………………………….....20

Conclusiones y Recomendaciones…………………………………………………..21

Fuentes consultadas…………………………………………..…………………….…22

Anexos…………………………………...………………………………………………23

I. ANTECEDENTES

Un método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión.

Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución.

En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos en un frigorífico de 4 estrellas.

II. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

Para la preparación de soluciones madres (medio de cultivo) se debe cumplir con una serie de normas, esto es para cualquier combinación ya que si no se cumplen como se debe el resultado no será exitoso, sino un total fracaso y de ser así nuevamente se realizaría la preparación del medio de cultivo. Es por ello que se debe tener un orden y sobre todo mucha concentración al preparar el medio, pero cabe mencionar que se requiere de un mayor número de balanzas analíticas debido a que el laboratorio solo cuenta con 2 y 2 no son suficientes ya que se pierde tiempo al esperar que se desocupen las balanzas para continuar con el proceso de preparación.

III. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Conocer los diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica.

3.2 Objetivos específicos

Ø Manejar las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.

Ø Comprender la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.

IV. JUSTIFICACIÓN

Esta práctica se realizó con la finalidad de conocer los diferentes componentes de un medio de cultivo así como su naturaleza química y bioquímica aunado a esto nos ayudo aprender a determinar los valores y la composición de una solución Stock, ya que se debe medir cuidadosamente en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración, debido a que durante el desarrollo de cualquier trabajo experimental relacionado con la propagación in vitro de explantes vegetales, el uso de soluciones Stock se hace indispensable, ya que estas comprenden el balance nutricional de los componentes de un medio de cultivo por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboración.

V. FUNDAMENTO TEORICO

5.1 MEDIO PARA CULTIVAR MATERIAL VEGETAL

Son muchos los elementos de un medio para cultivar material vegetal in vitro:

- Sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como macronutrientes

- Vitaminas tales como rivoflavina, tiamina, piridoxina, acido nicotínico, acido pantotenico, biotina y acido fólico

- Aminoácidos tales como L-glutamina, asparagina y cisteína

- Hexitoles como mio-inositol

- Hormonas y reguladores de crecimiento

- Fuente de carbono

- Agente gelificante

5.2 SOLUCIONES MADRE

Estas soluciones tienen una concentración que suele ser de 10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba solo en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están diluidos en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de los límites de exactitud de las balanzas de precisión. Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de precipitación.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales. Aminoácidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se conservan bien en solución; En el caso de las hormonas es mejor preparar una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y congelarlos en frigoríficos de 4 estrellas

Las soluciones deben prepararse con mucho cuidado y precisión. Las sales deben pesarse en una balanza granataria (precisión= 0.01 g) y en la balanza analítica se pesaran las vitaminas y reguladores de crecimiento (precisión = 0.0001 g). La conservación de las soluciones madres se hará de 4-5 C. en el refrigerador, es recomendable no prolongar por más de tres meses la conservación de las soluciones madres de sales minerales. Las que contengan vitaminas y sustancias de crecimiento estables podrán conservarse un máximo de 4 semanas.

5.3 FORMULACIONES PARA PREPARACION DE SOLUCIONES MADRE

Sales minerals MS (g/l)

(NH₄)NO₃ 1.650

KNO₃ 1.900

CaCl₂.2H₂O 0.440

MgSO₄.7H₂O 0.370

KH₂PO₄ 0.170

FeSO₄.7H₂O 0.0278

Na₂EDTA. 2H₂O 0.0372

MnSO₄.H₂O 0.0169

ZnSO₄.7H₂O 0.0086

H₃BO₃ 0.0062

KI 0.00083

Na₂MoO₄.2H₂O 0.00025

CuSO₄.5H₂O 0.000025

CoCl₂.6H₂O 0.000025

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotínico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002

5.4 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PESAR

- Comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las soluciones madre están expresados para un litro

- Leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas precauciones.

- Desde 0.01 g se utilizará la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza de precisión.

- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza.

- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la contaminación de los reactivos

- Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tomó.

5.5 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PREPARAR LAS DISOLUCIONES

- Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.

- Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del volumen total de agua

- Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté totalmente disuelto.

- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.

- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los siguientes datos:

Tipo de solución. Ej. Macro de MS

- Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la solución final)

- Componentes con fórmula y peso en g/l

- Fecha de preparación.

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

La practica tuvo lugar en el laboratorio de usos múltiples perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Para poder dar inicio con los procedimientos de esta, primeramente se organizaron lo estudiantes en seis grupos de trabajo, cada grupo prepararon una solución madre stock de Murashige & Skoog MS. Nuestro equipo trabajo en la preparación de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos; la práctica se desarrollo de la siguiente manera:

6.1 Cálculos Para Determinar Los Gramos Necesarios De La Solución De Fosfatos, Boratos Y Molibdatos

Se Realizaron previamente los cálculos necesarios para determinar los gramos exactos que se utilizaron de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.

REACTIVOS
COMPONENTES	NOMBRE	CANTIDAD EN g/L
KH₂PO₄	Fosfato Monopotásico	0.170
H₃BO₃	Ácido Bórico	0.062
Na₂MoO₄.2H₂O	Molibdato De Sodio Dihidratado	0.00025

Preparar 200 ml de solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentración de 100x

1) Fosfato Monopotásico. KH₂PO₄

La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplicó por la concentración que fue 100x y nos dio como resultado 17 g / L. Posteriormente se realizaron cálculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaríamos para un volumen de 200 mL, se realizó el siguiente procedimiento:

17 g 1000 mL

X 200 mL

(200 mL)(17 g) 3400 g/mL

= = 3.4 g

1000 mL 1000 mL

Teniendo en cuenta que se utilizan 17 g para un litro ( el cual es equivalente a 1000 mL ) a una concentración de 100x se multiplico el volumen que íbamos a emplear 200 mL por 17 g y se dividió en 1000 mL obteniendo como resultado 3.4 g, este mismo procedimiento se utilizo para los siguientes dos reactivos.

2) Ácido Bórico. H₃BO₃

6.2 g 1000 mL

X 200 mL

(200 mL)(6.2 g) 1200 g/mL

= = 1.24 g

1000 mL 1000 mL

3) Molibdato De Sodio Dihidratado. Na₂MoO₄.2H₂O

0.025 g 1000 mL

X 200 mL

(200 mL)(0.025 g) 5 g/mL

= = 0.005 g

1000 mL 1000 mL

6.2 Procedimiento en laboratorio para la preparación de la solución de Fosfatos, Boratos Y Molibdatos.

Una vez que se obtuvieron las cantidades de cada componente se procedió en el laboratorio a buscar cada uno de ellos en el área de reactivos, posteriormente se peso la cantidad que necesitaríamos de cada componente en la balanza analítica, se pesó 3.4 g de KH₂PO₄, 1.24 g de H₃B0₃y 0.005 g de Na₂MoO₄2H₂O.

Figura 1. Búsqueda e identificación Figura 2. Componentes de la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos. de cada componente de la solución.

Figura 3. Pesado de KH₂PO₄ 3.4 g. Figura 4. Pesado de H₃B0₃1.24 g.

Figura 5. Pesado de Na₂MoO₄2H₂O 0.005 g.

Contando ya con el peso exacto de cada uno de los componentes, en un matraz de Erlenmeyer se vertió 100 mL de agua destilada, después se agregó cada uno de los componentes, para tener la seguridad de que no quedaran residuos de las sales en los contenedores donde se pesaron se agregó aproximadamente 10 mL de agua para enjuagarlo y se incorporo al matraz, con ayuda de una pipeta se revolvió la solución hasta que las sales se disolviera perfectamente en el agua destilada. Se vació en una probeta graduada y se aforó a 200 mL, finalmente se vertió en una botella color ámbar previamente etiquetada con los siguientes datos: nombre de la solución madre, concentración y volumen de la misma, nombre del equipo y fecha de preparación, esta se tapó y se refrigeró a una temperatura de 9 ºC.

Figura 6. Vertido de agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen aproximado de 100 mL.

Figura 7. Agregado de un componente Figura 8. Enjuagado del contenedor

de la solución en agua destilada. del componente.

Figura 9. Dilución de los componentes

Figura 10. Vaciado de la solución Figura 11. Aforado en probeta a 200 de Fosfatos, Boratos y Molibdatos. mL

Figura 12. Vertido de solución madre de Fosfatos, Boratos y Molibdatos en una botella color ámbar.

VII. RESULTADOS

Una vez calculados los gramos a pesar para la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos se obtuvo lo siguiente:

REACTIVOS
COMPONENTES	NOMBRE	CANTIDAD EN g/L
KH₂PO₄	Fosfato Monopotásico	3.4 g
H₃BO₃	Ácido Bórico	1.24 g
Na₂MoO₄.2H₂O	Molibdato De Sodio Dihidratado	0.005 g

Así que una vez disueltos se obtuvo un solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos concentrada a 100X y lista para la preparación de medios de cultivo vegetales (MS).

Figura 13. Solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos (100X)

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

De acuerdo a los resultados de la presente practica se concluye que para obtener los resultados esperados se debe pesar correctamente los reactivos, disolverse en menos agua de la que se pretende aforar esto porque si disolvemos exactamente la cantidad de agua con la que se va aforar a la hora de enjuagar el recipiente la cantidad de agua es mayor y los resultados ya no son los esperados.

De acuerdo a lo antes mencionado se recomienda que los reactivos se acomoden de forma correcta de acuerdo a la sales que estos contengan como nitratos, sulfatos, quelatos, halógenos, etc. esto para encontrar más rápido los reactivos y no perder tiempo en ello ya que el tiempo de prácticas es muy corto y debe aprovecharse.

IX. FUENTES CONSULTADAS

- Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España

v http://www.rena.edu.ve/cuartaEtapa/quimica/Tema3.html

- http://www.veterinaria-online.com.ar/libros-gratis/preparacion-de-medios-de-cultivo-doc.html

-http://florescienciayalgomas.blogspot.com/2009/07/cultivo-in-vitro-preparacion-de.html

X. ANEXO

En la práctica realizada nos dimos cuenta que el laboratorio de biotecnología no cuenta con suficientes balanzas analíticas las cuales son esenciales para pesar las sustancias a utilizar en los medios de cultivo.

Fig. 1 Balanza analítica

Otro aspecto importante es que en el anaquel no se encuentran ordenadas las sustancias, es por ello que se recomienda que se ordenen de manera alfabéticamente.

Fig. 2 anaqueles

jueves, 9 de febrero de 2012

UNIDAD II

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO